Гистологические методы исследования
применяются для изучения строения и функции клеток и тканей человека, животных и растительных организмов в норме, патологии и эксперименте. Основой Г. м. и. является - комплекс методических приемов, используемых при изготовлении препаратов клеток и тканей для их микроскопического исследования. Микроскопическое изучение клеток и тканей может проводиться двумя основными путями в зависимости состояния исследуемого объекта: исследование живых клеток и тканей, исследование неживых клеток и тканей, сохраняющих структуру благодаря специальным приемам фиксации. Изучение живых объектов - витальное (суправитальное) - дает возможность наблюдать физиологические процессы в клетках и тканях, их прижизненное строение. Оно проводится на клетках, свободно взвешенных в жидкой среде (клетках крови, эпителиальных клетках соскобов и др.), а также на культурах клеток и тканей, выращенных на специальных питательных средах. Объектом прижизненного наблюдения могут быть тонкие, прозрачные тканевые пленки ( , плавательная перепонка). В экспериментальных исследованиях используется метод биологических окон (вживление прозрачных камер) и изучение тканевых имплантатов в естественной прозрачной среде, например в передней камере глаза животных. В зависимости от поставленной задачи при витальных исследованиях применяются различные специальные методы микроскопии: темнопольная, фазово-контрастная, флюоресцентная, поляризационная, ультрафиолетовая. Витальные гистологические методы применяются в основном для биологических и медико-биологических исследований. Их широкое применение ограничено большими техническими трудностями, связанными со свойствами переживающих тканей. В медицинских исследованиях, особенно в практике патолого-анатомических лабораторий, используются методы исследования фиксированных объектов. Цель фиксации сохранить прижизненную структуру клеток и тканей путем быстрого воздействия на них химическими агентами, предотвращающими развитие посмертных изменений.
Выбор метода фиксации зависит от задач исследования и особенностей фиксируемого материала. Так, для выявления тонких клеточных структур применяют фиксирующие смеси, содержащие соли тяжелых металлов (например, сулему) Лучшим фиксатором для цитологических целей служит четырехокись осмия, часто используемая и электронной микроскопии. Универсальным фиксатором является формальдегид, применяемый в виде 10% раствора формалина. Чтобы была равномерной и полной, кусочки ткани должны быть небольшими, а объем фиксирующей жидкости - во много раз превосходить объем фиксируемого материала. По окончании фиксации кусочки обычно промывают в воде или спирте. Твердые компоненты тканей (например, отложения солей кальция) удаляют с помощью методов декальцинации. Наиболее быстрым и простым способом приготовления среза ткани, применяемым обычно при экспресс-диагностике, является кусочка и получение срезов ткани на замораживающем микротоме. Однако при этом трудно получить достаточно тонкие срезы, а также срезы с мелких объектов и распадающихся тканей. Поэтому кусочки тканей, как правило, заливают в уплотняющие среды - или целлоидин. Фиксированную обезвоживают в спиртах возрастающей крепости, проводят через промежуточный растворитель (ксилол или для парафина, спирт-эфир для целлоидина) и пропитывают парафином или целлоидином. в парафин позволяет получить более тонкие срезы (от 5-8 до 1-2 мкм
), чем в целлоидин. Срезы для микроскопического исследования приготавливают с помощью санного или роторного микротомов. Сверхтонкие срезы (толщиной от 90-100 до 5-15 нм
), необходимые для электронно-микроскопических исследований, готовят на ультратоме. Ультратомы используют и в световой микроскопии для получения полутонких срезов. Приготовленные срезы окрашивают для четкого выделения структур клеток и тканей, которые по-разному воспринимают красители. Основные красители - красящие основания и их соли ( , толуидиновый синий, азуры, бисмарк коричневый) - окрашивают так называемые базофильные структуры (ядра клеток, соединительной ткани). Кислые красители - красящие кислоты и их соли (пикриновая кислота, эритрозин) - окрашивают ацидофильные, или оксифильные, структуры (цитоплазму клеток, коллагеновые, эластические волокна). окраски следует отличать импрегнацию - специальный метод, основанный на определенных участков клеток и тканей восстанавливать тяжелые металлы (например, серебра, золота, осмия) из их солей и за счет этого приобретать интенсивную окраску. Приготовление гистологического препарата завершается заключением его в среды, обеспечивающие сохранность структур объекта, его окраски и прозрачности. Наиболее часто для этих целей применяют органические смолы, например .
1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .
Смотреть что такое "Гистологические методы исследования" в других словарях:
Методические подходы и методы исследования в анатомии человека - Иногда приходится слышать о том, что в анатомии уже ничего не осталось для изучения, исследования, якобы все темы исчерпаны, все, что можно было изучать, уже изучено, все вопросы решены. Как будто бы все, что касается строения тела человека,… … Словарь терминов и понятий по анатомии человека
ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. см. ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Важнейшим условием получения достоверных результатов исследований является правильный выбор объектов анализа, своевременный их отбор и формулировка задачи исследования. Правила отбора проб … Болезни рыб: Справочник
I Медицина Медицина система научных знаний и практической деятельности, целями которой являются укрепление и сохранение здоровья, продление жизни людей, предупреждение и лечение болезней человека. Для выполнения этих задач М. изучает строение и… … Медицинская энциклопедия
Способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет… … Медицинская энциклопедия
- (гистологическое cytus клетка + греч. logos учение) основано на изучении с помощью микроскопа особенностей строения клеток, клеточного состава органов тканей, жидкостей организма человека и животных в норме и при патологических процессах. Ц. и.… … Медицинская энциклопедия
I Гистология (греч. histos ткань + logos учение) медико биологическая наука, изучающая эволюцию тканей, их развитие в организме (гистогенез), строение, функции и взаимодействие у многоклеточных животных и человека. Основной предмет изучения Г.… … Медицинская энциклопедия
I Вульва (vulva; pudendum femininum) наружные женские половые органы (по Международной анатомической номенклатуре женская половая область). Анатомия и физиология. Вульва (рис. 1) расположена снаружи от лобковых костей таза и прикрепленной к ним… … Медицинская энциклопедия
Изучая изменения, вызванные в организме различными болезненными процессами, имеет целью присущими ей методами исследования как определение этих болезненных процессов, так и значение их по отношению к клинической картине болезни и смертельному… … Энциклопедический словарь Ф.А. Брокгауза и И.А. Ефрона
I Биопсия (греч. bios жизнь + opsis зрение, зрительное восприятие) прижизненное взятие тканей, органов или взвеси клеток для микроскопического исследования с диагностической целью, а также для изучения динамики патологического процесса и влияния… … Медицинская энциклопедия
Наука, занимающаяся изучением тканей животных. Тканью называют группу клеток, сходных по форме, размерам и функциям и по продуктам своей жизнедеятельности. У всех растений и животных, за исключением самых примитивных, тело состоит из тканей,… … Энциклопедия Кольера
- (от греч. ἱστός ткань и греч. λόγος знание, слово, наука) раздел биологии, изучающий строение тканей живых организмов. Обычно это делается рассечением тканей на тонкие слои и с помощью микротома. В отличие от анатомии,… … Википедия
Книги
- Множественная миелома и плазмоклеточные заболевания , Рамасами Картик, Лониал Сагар. В книге представлены основные клинические аспекты множественной миеломы и других плазмоклеточных заболеваний. Описаны лабораторные исследования, патогенез, диагностика и лечение. Во втором…
Объектами исследования могут служить фиксированные (мертвые) или живые клетки и ткани.
Для исследования микроструктуры сырья и продуктов животноводства, как правило, используют фиксированные клетки и ткани. Препараты бывают временными, предназначенными для однократного изучения, и постоянными, которые можно сохранять и многократно исследовать. Кроме того, используют тотальные или целостные препараты.
Временные препараты можно приготовить сравнительно быстро; для этого исследуемый материал фиксируют и получают срезы на замораживающем микротоме, при его отсутствии можно сделать тоненький срез ткани или органа скальпелем или лезвием. Полученный срез окрашивают, помещают на предметное стекло, а затем наносят каплю глицерина и накрывают покровным стеклом. Для выявления крахмала используют раствор иода в йодистом калии: в небольшом количестве воды растворяют 0,5 г йодистого калия, вносят 1 г кристаллического иода и добавляют воды до 100 см 3 . На тоненький кусочек колбасы, сыра и другого материала, расположенный на предметном стекле, наносят несколько капель реактива, крахмал окрашивается в сине-фиолетовый цвет.
Тотальные или целостные препараты исследуют без получения среза ткани или органа. Например, пленку подкожной клетчатки или раздавленный препарат корешка растений после фиксации, промывки и окраски заключают между предметным и покровным стеклами. Для выявления отдельных структурных элементов фиксированные и окрашенные кусочки подкожной клетчатки или гладкой мышечной ткани расщипывают иглой на предметном стекле - такие препараты называют расщипанными. В ряде случаев, например исследуя пленку сетчатки глазного яблока или кожу головастика, после фиксации и промывки окраску не производят, так как в клетках имеются органические включения (пигмент), имеющие естественную окраску.
Методика подготовки гистологического препарата. Основным методом изучения фиксированных клеток и тканей является гистологический, т.е. исследование окрашенного среза ткани, заключенного в специальную среду. Для получения срезов используют заливку исследуемого материала в парафин или целлоидин, что позволяет получать тонкие срезы (5-7 мкм или 10-30 мкм соответственно), для быстрого приготовления срезов (40-60 мкм) используют замораживающую технику.
Основные этапы подготовки гистологического препарата: отбор проб, фиксация, промывка, обезвоживание, заливка в парафин или целлоидин, окрашивание, заключение под покровное стекло.
Отбор проб производится с учетом цели исследования и структуры материала. Размер пробы должен в среднем не превышать 2,5-3,0 см. Пробы печени, селезенки берут с капсулой. Из сердца вырезают кусочки предсердия, так как оболочки тоньше, чем в желудочках и на одном препарате можно видеть топографическое отношение эпикарда, миокарда и эндокарда. Из почек, лимфатических узлов, надпочечников вырезают участки органов, идущие вглубь перпендикулярно поверхности так, чтобы на препарате выявлялись корковое и мозговое вещество. При необходимости приготовить препараты измененных органов кусочки исследуемого материала вырезают на границе с пораженным участком, чтобы в пробу попала зона перехода очага поражения. Из скелетной мускулатуры пробы следует вырезать так, чтобы мышечные волокна были в продольном и поперечном сечении. Пробы образцов фарша, творога и других рассыпающихся образцов предварительно помещают в кусочек марли и перевязывают ниткой. Следует учитывать, что при вскрытии грудной полости легкие вследствие эластичности спадаются, значительно теряя воздушность, поэтому в трахею извлеченных дыхательных органов вставляют стеклянную или резиновую трубку, через которую умеренно вводят воздух. На трахею ниже вставленной трубки накладывают шелковую лигатуру, для полного погружения привязывают груз. Для фиксации кишечника предварительно перевязывают лигатурами с двух сторон участок органа, предназначенного для фиксации. Пробы снабжают этикетками из плотной бумаги с обозначением номера и даты отбора пробы.
Фиксация, т.е. сохранение естественной (прижизненной) архитектоники, проводится с целью перевести живую протоплазму структур в неизменяемое состояние. Действие фиксаторов проявляется в том, что в тканях и органах в результате биофизических процессов происходит необратимая коагуляция белков. Взятый из органа образец ткани как можно быстрее погружают в фиксатор; соотношение объема материала и фиксирующей жидкости должно быть не менее 1:9 (рис. 3).
Фиксация приводит к некоторому уплотнению и уменьшению объема образца. Чаще всего для фиксации используют 10-12%-ный формалин, этиловый спирт, ацетон. Для приготовления указанной концентрации фиксирующей жидкости 40%-ный формалин разбавляют водопроводной водой. Этиловый спирт (100%-ный абсолютный, или 96%-ный) применяют в тех случаях, когда нужно в срезах выявить вещества, растворяющиеся в водных фиксаторах (например, гликоген). В ацетоне исследуемый материал (например, головной мозг) фиксируют всего несколько часов. Когда в исследуемом органе, например костной ткани, содержится известь, проводится декальцинация или обызвествление. Для этого небольшой кусочек кости опускают (лучше подвесить на нитке) в 5-8%-ный водный раствор азотной кислоты, который за сутки меняют 2-3 раза. О результате декальцинации судят, вкалывая тонкую иглу в кость: если нет сопротивления - декальцинация закончена. После такой про-
Промывка проводится для удаления излишнего количества фиксатора, например после фиксации формалином промывку проводят проточной водопроводной водой.
Обезвоживание проводят для уплотнения материала в этиловом спирте восходящей концентрации: 50-70-100. Для приготовления 50%-ного и 70%-ного спирта 96%-ный спирт разбавляют дистиллированной водой. Чтобы приготовить 100%-ный спирт, необходимо медный купорос накалить до полного обезвоживания и в обезвоженный порошок белого цвета добавить 96%-ный этиловый спирт. В каждой концентрации спирта материал держат 1-24 ч в зависимости от величины кусочков, строения органа; в 70%-ном спирте материал можно держать в течение нескольких суток.
Заливка проводится такой средой, чтобы исследуемый образец стал твердым, что позволяет получать тонкие срезы. Для этого используют парафин (пропитка 1-4 ч), целлоидин (пропитка три недели). При выявлении жиров и для исследования рыхлых тканей и органов используют заливку в желатин.
Срезы получают на санных или ротационных микротомах. Наиболее тонкие срезы (5-7 мкм) удается изготовить из материала, залитого в парафин. Из материала, залитого целлоидином, готовят срезы толщиной 15-20 мкм. Для исследования микроструктуры сырья и продуктов животного происхождения, как правило, используют замораживающую технику. Это ускоряет изготовление препарата, так как исключаются длительные этапы обезвоживания и заливки. После фиксации и промывки кусочки объекта помещают на влажный предметный столик замораживающего микротома и получают срезы толщиной 40-60 мкм. Срезы переносят кисточкой в воду, где они расправляются, приобретая вид тончайших сероватых лоскутков.
Окрашивание срезов проводят для увеличения контрастности различных структур в препаратах, предназначенных для исследования в световом микроскопе. В процессе окрашивания происходят сложные химические и физические процессы, поэтому при выборе метода учитывают избирательное сродство структур клетки к определенным красителям с разными физико-химическими свойствами.
Различают красители основные (базальные), кислые и специальные. Структуры, окрашивающиеся основными красителями, называются базофильными, кислыми красителями - оксифильными, ацидофильными, эозинофильными.
Из основных (базальных) красителей используют гематоксилин, окрашивающий хроматин ядра и другие структуры, содержащие белок, в синий или фиолетовый цвет; кармин, окрашивающий ядро в светло-красный цвет, сафранин - темно-красная краска, тионин - синяя краска.
Из кислых красителей применяют эозин (окрашивает цитоплазму в розовый цвет), пикриновую кислоту (желтый цвет), фуксин (кирпичный цвет), индиго кармин (синий цвет).
При исследовании микроструктуры сырья и продуктов животноводства наиболее часто используется комбинированная окраска гематоксилином и эозином. Для этого срезы из воды на 1-3 мин переносят в раствор гематоксилина; 20-30 мин промывают в воде, на 3-5 мин помещают в раствор эозина и 3-5 мин промывают водой. Оставшуюся воду удаляют фильтровальной бумагой, наносят каплю 96%-ного этилового спирта на 1-2 мин, обезвоживают в 25%-ном растворе карболовой кислоты в ксилоле или толуоле. Затем на срез наносят 1-2 капли бальзама и закрывают покровным стеклом.
Из красителей, окрашивающих жировые включения часто используют судан 111. Для приготовления раствора красителя в 95 см 3 85%-ного этилового спирта добавляют 5 см 3 ацетона и насыпают порошок Судана III до получения насыщенного раствора (краситель должен содержаться в избытке). Смесь нагревают до 50% С и фильтруют. Срезы, полученные на замораживающем микротоме, помещают в 50%-ный этиловый спирт на 1-2 мин, а затем в судан III на 25 мин. Срезы ополаскивают в 50%-ном спирте, промывают дистиллированной водой и заключают в глицерин-желатин.
Капли нейтрального жира окрашиваются в оранжевый цвет за счет растворения Судана III в жирах. Выявить жировые включения можно также осмиевой кислотой, при этом жировые структуры окрашиваются в черный цвет.
Заключение под покровное стекло проводят в среды, не пропускающие воздух и способные долго сохранять срез. Окрашенные срезы обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и заключают под покровное стекло в пихтовый, канадский бальзам или глицерин- желатин (препарат не должен соприкасаться со спиртами и ксилолом).
Подготовка препаратов для электронной микроскопии. Для исследования биологических объектов используют два вида электронных микроскопов: просвечивающий (трансмиссионный) и сканирующий (растровый).
Принцип обработки объекта для исследования в просвечивающем электронном микроскопе основан на тех же положениях, что и для оптических микроскопов: отбор проб, фиксация, промывание, обезвоживание, заливка, приготовление ультратонких срезов, контрастирование.
Отбор проб производится с учетом цели исследования и структуры материала, с соблюдением тех же правил, что и для световой микроскопии. Объем кусочков исследуемого материала не должен превышать 1 мм 3 . Главная цель фиксации - сохранить ткань по возможности близкой к прижизненному состоянию.
Фиксация проводится для лучшей сохранности структур, поэтому необходимо применять реактивы, имеющие определенные pH и изо- тоничность, величины которых определяются видом фиксируемой ткани. Процесс фиксации проводится в два этапа: префиксация и постфиксация. Для префиксации применяют раствор 2,5-3%-ного раствора глютарового альдегида (pH 7,2-7,4), продолжительность фиксации 2-4 ч. Постфиксацию осуществляют в 2%-ном растворе (pH 7,2-7,4) - 1-2 ч. Для сохранения прижизненной структуры рекомендуется использовать фиксатор низкой температуры (0-4 °С), и готовить фиксаторы на фосфатно-буферных, какодилатных, веро- нал-ацетатных растворах.
Промывка проводится 30%-ным холодным спиртом 5-7 раз, в каждой порции спирта выдерживают объект в течение 30 мин, т.е. отмывают от фиксатора до такого состояния, когда прекращаются окисляющее действие фиксатора.
Обезвоживание проводят этиловыми спиртами возрастающей крепости: 30, 50, 70, 96, 100% по 30 мин. При некоторых методах заливки для обезвоживания рекомендуется дополнительно использовать ацетон и пропиленоксид.
Заливка проводится в эпоксидные смолы (аралдит, эпон и др.). Полимеризацию смол в капсулах проводят в термостате при 60 °С до затвердения, как правило, в течение 1-2 суток.
Ультратонкие срезы получают с помощью стеклянных ножей на ультрамикротоме, для этого эпоксидные блоки затачивают в форме четырехгранной усеченной пирамиды. Серийные срезы сероватого цвета поступают в ванночку с 10%-ным этиловым спиртом. Полученные срезы монтируют на медные или палладиевые сеточки, на поверхность которых предварительно наносят пленку из формвара. Для выявления необходимых структур срезы на сеточках обрабатывают растворами цитрата свинца и уранилацетата.
Для сканирующей электронной микроскопии исследуемый образец фиксируют, обезвоживают в зависимости от цели исследования, используя вышеуказанные фиксаторы. После обезвоживания образец приклеивают на объект-держатель, помещают в напылительную установку и покрывают тончайшим слоем золота или платины. В отличие от просвечивающей электронной микроскопии для сканирующей можно использовать коррозийные препараты: объект изучения заливают какими-либо затвердевающими веществами и после этого просматривают слепки и поверхности. Изучают также реплики, получаемые путем замораживания - скалывания. В этом случае исследуют слепок скола поверхности объекта. Чтобы увеличить контрастность, реплики необходимо оттенить с помощью напыления частиц металлов (золота, платины) или угля.
Контрольные вопросы
- 1. Какие методы используют при исследовании структур клеток, тканей и органов?
- 2. Какие основные правила следует соблюдать при отборе проб для подготовки гистологических препаратов?
- 3. Каковы особенности подготовки препаратов из костной ткани?
- 4. В чем фиксируют исследуемый материал?
- 5. Что используют для обезвоживания препаратов?
- 6. Какие среды используют для заливки исследуемого материала?
- 7. Какой краситель используют для выявления жировой ткани?
- 8. Какой метод получения срезов чаще всего используют и почему?
- 9. Назовите основные этапы подготовки препаратов для просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии.
Гистология – («гистос» греч. – ткань, логис - учение) Это наука о строении, развитии и жизнедеятельности тканей многоклеточных организмов и человека. Невооруженному глазу недоступны объекты, являющиеся предметом этой науки. Поэтому и история гистологии тесно связана с истроией создания таких приборов, которые позволяют изучить мельчайшие предметы, невооруженным глазом. 2
Курс гистологии условно разделен на следующие разделы: n 1. Цитология - наука о клетке. n 2. Эмбриология - наука о развитии, от зарождения до полного формирования организма. n 3. Общая гистология - наука об общих закономерностях, присущих тканям. n 4. Частная гистология - изучает строение, развитие органов и систем.
ЦИТОЛОГИЯ – (греч. κύτος «клетка» и λόγος - «учение» , «наука») n Раздел биологии, изучающий живые клетки, их органоиды, их строение, функционирование, процессы клеточного размножения, старения и смерти. 4
ЭМБРИОЛОГИЯ n (от др. -греч. ἔμβρυον - эмбрион, зародыш + -λογία от λόγος - учение) - это наука, изучающая развитие зародыша. 5
История создания клеточной теории 1590 год. Янсен изобрел микроскоп, в котором увеличение обеспечивалось соединением двух линз. 1665 год. Роберт Гук впервые употребил термин клетка. 1650 -1700 годы. Антони ван Левенгук впервые описал бактерии и другие микроорганизмы. 1700 -1800 годы. Опубликовано много новых описаний и рисунков различных тканей, преимущественно растительных. 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих. 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. 1838 -1839 годы. Ботаник Матиас Шлейден и зоолог Теодор Шванн объединили идеи разных ученых и сформулировали клеточную теорию, которая постулировала, что основной единицей структуры и функции в живых организмах является клетка. 1855 год. Рудольф Вирхов показал, что все клетки образуются в результате клеточных делений.
История создания клеточной теории 1665 год. Рассматривая под микроскопом срез пробки, английский ученый, физик Роберт Гук обнаружил, что она состоит из ячеек, разделенных перегородками. Эти ячейки он назвал "клетками"
История создания клеточной теории В XVII столетии Левенгук сконструировал микроскоп и открыл людям дверь в микромир. Перед глазами изумленных исследователей замелькали разнообразнейшие инфузории, коловратки и прочая мельчайшая живность. Оказалось, что они повсюду – эти мельчайшие организмы: в воде, навозе, в воздухе и пыли, в земле и водосточных желобах, в гниющих отходах животного и растительного происхождения.
История создания клеточной теории 1831 -1833 годы. Роберт Броун описал ядро в растительных клетках. В 1838 г. немецкий ботаник М. Шлейден привлек внимание к ядру, считал его образователем клетки. По Шлейдену, из зернистой субстанции конденсируется ядрышко, вокруг которого формируется ядро, а вокруг ядра - клетка, причём ядро в процессе образования клетки может исчезать.
История создания клеточной теории Немецкий зоолог Т. Шванн показал, что из клеток состоят и ткани животных. Он создал теорию, утверждающую, что клетки, содержащие ядра, представляют собой структурную и функциональную основу всех живых существ. Клеточная теория строения была сформулирована и опубликована Т. Шванном в 1839 г. Суть её можно выразить в следующих положениях: 1. Клетка – элементарная структурная единица строения всех живых существ; 2. Клетки растений и животных самостоятельны, гомологичны другу по происхождению и структуре. Каждая клетка функционирует независимо от других, но вместе со всеми. 3. Все клетки возникают из бесструктурного межклеточного вещества. (Ошибка!) 4. Жизнедеятельность клетки определяется оболочкой. (Ошибка!)
История создания клеточной теории В 1855 г. немецкий врач Р. Вирхов сделал обобщение: клетка может возникнуть только из предшествующей клетки. Это привело к осознанию того факта, что рост и развитие организмов связаны с делением клеток и их дальнейшей дифференцировкой, приводящей к образованию тканей и органов.
История создания клеточной теории Карл Бэр Еще в 1827 году Карл Бэр обнаружил яйцеклетку у млекопитающих, доказал, что развитие млекопитающих начинается с оплодотворенной яйцеклетки. Значит развитие любого организма начинается с одной оплодотворенной яйцеклетки, клетка является единицей развития.
История создания клеточной теории 1865 г. Опубликованы законы наследственности (Г. Мендель). 1868 г. Открыты нуклеиновые кислоты (Ф. Мишер) 1873 г. Открыты хромосомы (Ф. Шнейдер) 1874 г. Открыт митоз у растительных клеток (И. Д. Чистяков) 1878 г. Открыто митотическое деление животных клеток (В. Флеминг, П. И. Перемежко) 1879 г. Флеминг – поведение хромосом во время деления. 1882 г. Открыт мейоз у животных клеток (В. Флеминг) 1883 г. Показано, что в половых клетках число хромосом в два раза меньше, чем в соматических (Э. Ван Бенеден) 1887 г. Открыт мейоз у растительных клеток (Э. Страсбургер) 1898 г. Гольджи открыл сетчатый аппарат клетки, аппарат Гольджи. 1914 г. Сформулирована хромосомная теория наследственности (Т. Морган). 1924 г. Опубликована естественно-научная теория происхождения жизни на Земле (А. И. Опарин). 1953 г. Сформулированы представления о структуре ДНК и создана ее модель (Д. Уотсон и Ф. Крик). 1961 г. Определены природа и свойства генетического кода (Ф. Крик, Л. Барнет, С. Беннер).
Основные положения современной клеточной теории 1. Клетка - элементарная живая система, единица строения, жизнедеятельности, размножения и индивидуального развития организмов. 2. Клетки всех живых организмов гомологичны, едины по строению и происхождению. 3. Образование клеток. Новые клетки возникают только путем деления ранее существовавших клеток. 4. Клетка и организм. Клетка может быть самостоятельным организмом (прокариоты и одноклеточные эукариоты). Все многоклеточные организмы состоят из клеток. 5. Функции клеток. В клетках осуществляются: обмен веществ, раздражимость и возбудимость, движение, размножение и дифференцировка. 6. Эволюция клетки. Клеточная организация возникла на заре жизни и прошла длительный путь эволюционного развития от безъядерных форм (прокариот) к ядерным (эукариотам).
МЕТОДЫ МИКРОСКОПИРОВАНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 1. Световая микроскопия. 2. Ультрафиолетовая микроскопия. 3. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. 4. Фазово-контрастная микроскопия. 5. Микроскопия в темном поле. 6. Интерференционная микроскопия 7. Поляризационная микроскопия. 8. Электронная микроскопия. 17
Микроскоп n Этот оптический прибор позволяет наблюдать мелкие объекты. Увеличение изображения достигается системой линз объектива и окуляра. Зеркало, конденсор и диафрагма направляют световой поток и регулируют освещение объекта. Механическая часть микроскопа включает: штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубусодержатель. 18
Специальые методы микроскопирования: - фазовоконтрастный микроскоп - (для изуч. живых неокраш-х обьектов)- микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии. - темнопольный микроскоп (для изуч. живых неокраш-х обьектов). Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещённый на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи. 19
Специальые методы микроскопирования люминесцентный мик-п (для изуч. живых неокраш-х обьектов) микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флюоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра. -ультрафиолетовый способность м-па) мик-п (повышает разрешающую -поляризационный мик-п (для иссл. обьектов с упорядочонным располажением молекул - скелет. муск-ра, коллагеновые волокна и т. д.) микроскопия – формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы). 20
Специальые методы микроскопирования -интерфекренционная микроскопия (для опред-я сухового остатка в клетках, определение толщины обьектов) - микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов. Специальная интерференционная оптика (оптика Номарского) нашла применение в микроскопах с дифференциальным интерференционным контрастом. В. Электронная микроскопия: -трансмиционная (изучение обьектов на просвет) -сканирующий (изучение поверхности обьектов) Теоретически разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0, 002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0, 1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм. 21
Специальые методы микроскопирования Просвечивающий электронный микроскоп состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки. Сканирующий электронный микроскоп применяют для получения трёхмерного изображения поверхности исследуемого объекта. Метод сколов (замораживание-скалывание) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. 22
Специальные (немикроскопические) методы: 1. Цито- или гистохимия - суть заключается использовании строгоспецифических химических реакций с светлым конечным продуктом в клетках и тканях для определения количества различных веществ(белков, ферментов, жиров, углеводов и т. д.). Можно применить на уровне светового или электронного микроскопа. 2. Цитофотометрия - метод применяется в комплексе с 1 и дает возможность количественно оценить выявленные цитогистохимическим методом белки, ферменты и т. д. 3. Авторадиография - вводят в организм вещества, содержащие радиоактивные изотопы химических элементов. Эти вещества включаются в обменные процессы в клетках. Локализацию, дальнейшие перемещения этих веществ в органах определяются на гистопрепаратах по излучению, которое улавливается фотоэмульсией, нанесенной на препарат. 4. Рентгентоструктурный анализ - позволяет определить количество химических элементов в клетках, изучить молекулярную структуру биологических микрообьектов. 24 5. Морфометрия - измерение размеров биол. структур на клеточном и субклеточном уровне.
Специальные (немикроскопические) методы 6. Микроургия - проведение очень тонких операций микроманипулятором под микроскопом (пересадка ядер, введение в клетки различных веществ, измерение биопотенциалов и т. д.) 6. Метод культивирования клеток и тканей - в питательных средах или в диффузионных камерах, имплантированных в различные ткани организма. 7. Ультрацентрофугирование - фракционирование клеток или субклеточных структур путем центрофугирования в растворах различной плотности. 8. Экспериментальный метод. 9. Метод трансплантации тканей и органов. 25
Фиксация сохраняет структуру клеток, тканей и органов, предотвращает их бактериальное загрязнение и ферментное переваривание, стабилизирует макромолекулы путём их химического сшивания. 32
Фиксирующая жидкость формалин, спирты, глутаральдегид - Наиболее распространённые фиксаторы; Криофиксация - Лучшую сохранность структур обеспечивает мгновенное замораживание образцов в жидком азоте (– 196 °С); Лиофилизация – небольшие кусочки ткани подвергаются быстрому замораживанию, прекращающему метаболические процессы. Обезвоживание- стандартная процедура удаления воды-обезвоживание в спиртах, возрастающей крепости (от 70 до 60%). Заливка – делает ткань прочной, предотвращает её раздаваливание и сминание при резании, дает возможность получать срезы стандартной толщины. Наиболее распространенная среда для заливки – парафин. Используют также – целлоидин, пластически среды и смолы. 33
Обезвоживание готовит фиксированную ткань к проникновению в неё сред для заливки. Вода живой ткани, а также вода фиксирующих смесей (большинство фиксаторов – водные растворы) после фиксации должна быть полностью удалена. Стандартная процедура удаления воды – обезвоживание в спиртах возрастающей от 60° до 100° крепости. 34
Заливка – необходимая процедура, предваряющая приготовление срезов. Заливка делает ткань прочной, предотвращает её раздавливание и сминание при резании, даёт возможность получить тонкие срезы стандартной толщины. Наиболее распространённая среда для заливки – парафин. Используют также целлоидин, пластические среды и смолы. 35
Ротационный микротом. 40 n Блоки, содержащие кусочек органа, закрепляют в подвижном объектодержателе. При его опускании на ноже остаются серийные срезы, их снимают с ножа и монтируют на предметное стекло для последующей обработки и микроскопирования.
Методы окраски гистосрезов: n Ядерные (основные): n гематоксилин – окрашивает n n n n ядра в синий цвет; железный гематоксилин; азур II (в фиолетовый); кармин (в красный); сафранин (в красный); метиловый синий (в синий); толуидиновый (в синий); тиониновый (в синий). n Цитоплазматические- (кислые): n эозин – в розовый; n эритрозин; n оранжевый «G» ; n кислый фуксин –в красный; n пикриновая кислота - в желтый; n конго –красный – в красный 44
СПЕЦИАЛЬНЫЕ Методы окраски гистосрезов n Судан III –окраска липидов и жиров в оранжевый цвет; n осмиевая кислота – окраска липидов и жиров в черный цвет; n орсеин -окраска эластических волокон в коричневый цвет; n азотнокислое серебро – импрегнация нервных элементов в темнокоричневый цвет. 45
Структуры клеток: n ОКСИФИЛИЯn способность окрашиваться кислыми красителями в розовый цвет n Базофилияn способность окрашиваться основными красителями в синий цвет n Нейтрофилия – n способность окрашиваться кислыми и основными красителями в фиолетовый цвет. 47
1
Клетка n - это элементарная живая система, состоящая из цитоплазмы, ядра, оболочки и являющаяся основой развития, строения и жизнедеятельности животных и растительных организмов.
Гликокаликс- надмембранный комплекс, состоит из сахаридов, связанных с белками и сахаридов, связанных с липидами. Функции n Рецепция (гормоны, цитокины, медиаторы и антигены) n Межклеточные взаимодействия(раздражимость и узнавание) n Пристеночное пищеварение (микроворсинки каемчатых клеток кишечника)
Функции цитолеммы: - разграничительная; - активный и пассивный транспорт веществ в обе стороны; - рецепторные функции; -контакт с соседними клетками.
Основными Объектами исследования являются гистологические препараты, а главным методом исследования - микроскопирование.
Гистологический препарат должен быть достаточно прозрачным (тонким) и контрастным. Он изготавливается как из живых, так и из мёртвых (фиксированных) структур. Препарат может представлять собой взвесь клеток, мазок, отпечаток, плёнку, тотальный препарат и тонкий срез.
Процесс изготовления гистологических препаратов для микроскопических исследований включает в себя следующие основные этапы: 1) взятие материала и его фиксация; 2) уплотнение материала; 3) приготовление срезов; 4)окрашивание, или контрастирование срезов; 5) заключение срезов.
Для окрашивания применяются специальные гистологические красители с различным значением рН: кислые, нейтральные и основные. Структуры, окрашивающиеся ими, соответственно, называются оксифильными, нейтрофильными (гетерофильными) и базофильными.
Какими же методами пользуется гистологическая наука? Они довольно многочисленны и разнообразны:
Микроскопирование.
Световая микроскопия. Современные микроскопы обладают высокоразрешающей способностью. Разрешающая способность определяется наименьшим расстоянием (d) между двумя рядом расположенными точками, которые можно видеть раздельно. Это расстояние зависит от длины световой волны (λ) и выражается формулой: d = 1/2 λ.
Минимальная длина волны видимой части спектра 0,4 мкм. Следовательно, разрешающая способность светового микроскопа составляет 0,2 мкм, а общее увеличение достигает 2500 раз.
Ультрафиолетовая микроскопия . Длина волны ультрафиолетового света – 0,2 мкм, следовательно, разрешающая способность ультрафиолетового микроскопа 0,1 мкм, но так как ультрафиолетовое излучение является невидимым, то для наблюдения исследуемого объекта необходим люминесцентный экран.
Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Коротковолновое (невидимое) излучение, поглощаясь рядом веществ, возбуждает их электроны, которые излучают свет с большей длиной волны, становясь видимой частью спектра. Таким образом, добиваются повышения разрешающей способности микроскопа.
Фазовоконтрастная микроскопия позволяет излучать неокрашенные объекты.
Поляризационная микроскопия применяется для изучения архитектоники гистологических структур, например, коллагенового волокна.
Электронная микроскопия даёт возможности изучать объекты, увеличенные в десятки тысяч раз.
Микрофотосъёмка и микрокиносъёмка . Эти методы позволяют изучать фиксированные объекты на фотографиях и живые микроскопические объекты в движении.
Методы качественных и количественных исследований.
Гисто – и цитохимия , в том числе количественная, позволяет проводить качественный анализ исследуемых объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях.
Цитоспектрофотометрия Даёт возможность изучать количественное содержание тех или иных биологических веществ в клетках и тканях на основе поглощения света определённой длины волны связанным ими красителем.
Дифференциальное центрифугирование позволяет разделять содержимое клеток, отличающихся между собой своей массой.
Радиография Основана на включении радиоактивной метки (например, радиоактивного йода, Н³-тимидина и др.) в обменный процесс.
Морфометрия позволяет производить измерение площадей и объёмов клеток, их ядер и органелл с помощью окуляр - и объект-микрометров и специальных сеток.
Применение ЭВМ для автоматической обработки цифрового материала.
Метод культуры тканей представляет собой поддержание жизнеспособности и деления клеток и тканей вне организма. Для этого используют специальные контейнеры с питательной средой, в которых создаются все необходимые условия для жизнедеятельности клеток. С помощью этого метода можно изучать дифференцировку и функциональное становление клеток, закономерности их злокачественного перерождения и развития опухолевого процесса, межклеточное взаимодействие, поражение клеток и тканей вирусами и микроорганизмами, влияние лекарственных препаратов на обменные процессы в клетках и тканях и т. д.
Прижизненное (витальное) окрашивание используется для изучения явлений фагоцитоза и активности макрофагов, фильтрационной способности почечных канальцев и др.
Метод трансплантации тканей . Этот метод применяют с целью изучения поведения клеток и их морфофункционального состояния при их пересадке в другой организм. К примеру, этот метод используется для поддержания жизни животных, подверженных облучению смертельной дозой.
Микроманипуляции. Данный метод получил применение в молекулярной биологии, генной инженерии, а также при клонировании, когда с помощью микроманипулятора удаляют ядро из яйцеклетки с гаплоидным набором хромосом и пересаживают в неё ядро соматической клетки с диплоидным набором хромосом.
Существует множество методов исследования , среди которых выделяются следующие: наблюдение за живыми зародышами с применением кино- и видеосъемки (используется в основном в эксперименте). Для этого применяется специальная микрофотоустановка, соединяющаяся с термокамерой, в которой развивается зародыш. При изучении развития куриного эмбриона, например, в скорлупе проделываете» окошечко, которое закрывается прозрачной пластинкой. Данный метод позволил проследить и уточнить динамику изменения формы и размеров зародышей в процессе развития.
Метод изучения фиксированных срезов зародышей с помощью световой и электронной микроскопии, гисторадиоавтографии, гисто- и иммуноцитохимии. Эти методы позволяют анализировать тканевые и внутриклеточные изменения в динамике развития частей зародыша. С помощью гисто- и иммуноцитохимических методов исследуются биохимические процессы, происходящие в клетках зародышей, - синтез ДНК, РНК, белков, специфических рецепторных белков и др. С применением этих методов была получена важная информация о клеточной и тканевой дифференцировке в развитии эмбрионов и плодов.
Метод маркировки , предложенный в 1925 г. В. Фогтом (1888-1941), позволяет изучать перемещения клеток в развивающемся зародыше. Для этого применяются нетоксичные для зародышей маркеры (например, нейтральный красный, частицы древесного угля), а также антитела к определенным белкам. При применении антител используется их свойство соединяться с флюоресцирующим красителем и белками зародыша. С помощью флюоресцентной микроскопии прослеживается распределение красителя и исследуется динамика белкового синтеза в развивающихся тканях зародыша.
Методы микрохирургии разрабатывались в начале XX века представителями школы Г. Шпемана (1869-1941). Они включали: снятие оболочек яиц животных, пересадку частей одного зародыша другому и др. Данные методы используются также для изучения последствий разрушения (например, с помощью лазерного луча) частей зародыша или его отдельных клеток. Трансплантацию как разновидность микрохирургии используют для выявления путей миграции клеток и источников развития тканей. При этом пересаживают участок зародыша, например перепела, в тот же участок куриного зародыша на место удаленного участка. Ядра клеток перепела имеют характерную структуру и поэтому отличимы от ядер клеток зародыша курицы.
Эксплантация - иссечение небольшого участка зародыша и выращивание его на искусственной среде. С помощью этого метода можно получать информацию об источниках развития тканей из данного участка зародыша и выявлять гистогенетические закономерности развития.
Трансплантация ядер - метод, позволяющий клонировать зародышей. Например, пересадка ядер из клеток эпителия кишки головастика шпорцевой лягушки в икринку лягушки, ядро которой было инактивированно ультрафиолетовым лучом, привела к появлению новых особей (опыты Гердон). Данные опыты заложили основу клонирования высших позвоночных и способствовали появлению (в 1997 г.) знаменитой овцы Долли. Подобные эмбриологические эксперименты убедительно показали, что ядра соматических клеток содержат полный набор генетической информации для развития нового организма.
Новейшим достижением экспериментальной эмбриологии явилась разработка метода экстракорпорального оплодотворения. Пересадка зародышей, зачатых в пробирке, в матку составляет основу лечения бесплодия. В 1973 г. Л. Шеттлз (США) извлек предовуляторную яйцеклетку из яичника бесплодной женщины и оплодотворил ее сперматозоидами мужа. Так было положено начало технике пересадки зародышей человека с целью лечения бесплодия. Однако только в 1978 г. в Великобритании в результате успешной пересадки в матку бесплодной женщины зародыша человека на стадии 8 бластомеров после 2,5 суток культивирования появился первый в мире "пробирочный" ребенок массой 2700 г.